Woche 8&9 — Spektrophotometrie

Einleitung

In diesem Laborposten werden Sie sich mit dem Thema Spektrophotometrie

Analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz durch Messung der Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge.

und deren Anwendung vertraut machen. Insbesondere werden Sie sich mit dem Lambert-Beer'schen Gesetz

Gesetz, das den linearen Zusammenhang zwischen Lichtabsorption und Konzentration einer Substanz beschreibt.

und dessen Anwendungskriterien beschäftigen. Schliesslich werden Sie die Spektrophotometrie

Analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz durch Messung der Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge.

mit einigen der bisher erlernten Techniken in einem Experiment kombinieren, um qualitative Analysen

Analyse, die sich auf die Identifizierung der Bestandteile einer Probe konzentriert.

und quantitative Analysen

Analyse, die sich auf die Bestimmung der Mengenverhältnisse von Bestandteilen einer Probe konzentriert.

durchzuführen.

Lernziele

1. Sie verstehen das Prinzip der UV/VIS-Spektrophotometrie und den Aufbau eines Spektrophotometers.
2. Sie kennen die grundlegenden Begriffe Transmission, Extinktion, Absorption, optische Dichte (OD) und Lichtstreuung.
3. Sie können den mathematischen Zusammenhang zwischen Transmission und Extinktion erläutern und entsprechende Werte umrechnen.
4. Sie verstehen das Lambert-Beer’sche Gesetz und können es anwenden, einschliesslich der Bedeutung von Schichtdicke, Konzentration und molarem Extinktionskoeffizienten (ε).
5. Sie können eine Standardkurve erstellen, auswerten und zur Konzentrationsbestimmung nutzen.
6. Sie erkennen die Bedingungen, Grenzen und Fehlerquellen der spektrophotometrischen Analyse (z. B. linearer Bereich, Detektionsgrenze, Streuung).

Einführung in die Spektrophotometrie

Die UV/VIS-Spektroskopie ist eine zentrale analytische Methode, die auf der Messung der Wechselwirkung zwischen elektromagnetischer Strahlung und Materie basiert. Sie dient sowohl der qualitativen Identifizierung als auch der quantitativen Bestimmung chemischer Substanzen.

Licht stellt eine Form elektromagnetischer Strahlung dar, die sich als periodische Schwingung elektrischer und magnetischer Felder ausbreitet. Der Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Wellenmaxima oder -minima wird als Wellenlänge (λ) bezeichnet und in Nanometern (nm) angegeben.

Der für die UV/VIS-Spektroskopie relevante Spektralbereich umfasst ultraviolettes Licht (λ ≈ 190–400 nm) und sichtbares Licht (λ ≈ 400–700 nm).

Die Summe aller Wellenlängen wird als Spektrum bezeichnet.

Farbabsorption

Die Wahrnehmung von Farbe ist das Ergebnis einer komplexen Wechselwirkung zwischen den optischen Eigenschaften von Materie, den physiologischen Prozessen des visuellen Systems und der Interpretation durch das zentrale Nervensystem.

Weisses Licht, wie z. B. Sonnenlicht, enthält ein kontinuierliches Spektrum elektromagnetischer Wellen im sichtbaren Bereich von etwa 380 nm (Violett) bis 780 nm (Rot). Trifft dieses Licht auf ein Objekt, werden bestimmte Wellenlängen durch das Material absorbiert, während andere reflektiert oder transmittiert werden. Die Summe der reflektierten bzw. durchgelassenen Wellenlängen bestimmt die wahrgenommene Farbe des Objekts. Ein typisches Beispiel ist der Farbstoff in einem grünen Blatt: Chlorophyll, das wichtigste Pigment im Blatt. Es absorbiert Licht im blauen (ca. 430–480 nm) und roten Bereich (ca. 640–680 nm) des sichtbaren Spektrums nahezu vollständig. Der Wellenlängenbereich zwischen etwa 500 nm und 550 nm wird hingegen kaum absorbiert, sondern reflektiert. Da dieser Bereich dem grünen Spektralbereich entspricht, nehmen wir das Blatt als grün wahr.

Wenn ein Gegenstand keine sichtbaren Wellenlängen absorbiert, sondern alle im gleichen Masse reflektiert, werden im Auge alle Typen von Farbrezeptoren (Zapfen) gleich stark stimuliert – der Gegenstand erscheint weiss.

Absorbiert ein Gegenstand hingegen alle sichtbaren Wellenlängen nahezu vollständig, wird kaum oder gar kein Licht reflektiert. In diesem Fall erhalten die Farbrezeptoren keine oder nur minimale Reize, und der Gegenstand erscheint schwarz.

Komplementäre Farbe

Zwei Farben bezeichnet man als komplementär zueinander, wenn ihre Mischung die Farbe Weiss ergibt.

Komplementärfarben

Bewegen Sie den Mauszeiger über das Farbrad

Tabelle:Komplementärfarben mit den entsprechenden Wellenlängen

Farbe	Wellenlänge (nm)	Komplementärfarbe	Wellenlänge (nm)
Rot	630–700	Cyan	490–520
Grün	490–560	Magenta	380–450 / 630–700
Blau	450–490	Gelb	560–630
Gelb	560–630	Blau	450–490
Cyan	490–520	Rot	630–700
Magenta	380–450 / 630–700	Grün	490–560
Orange	590–630	Blaugrün	490–520
Violett	380–450	Gelbgrün	490–560
Rosa	630–700	Türkis	490–520

Tipp

Wenn mehrere Wellenlängen des sichtbaren Lichts absorbiert werden, nimmt das Auge die Summe der reflektierten oder durchgelassenen Spektralanteile als eine Mischfarbe wahr.

Die Lichtabsorption kann in der analytischen Chemie zur Charakterisierung und Quantifizierung von Substanzen verwendet werden. Die Aufnahme der Absorptionsspektren von verschiedenen Substanzen erfolgt mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrophotometers

Spektrophotometer

Ein Spektrophotometer ist ein analytisches Instrument, das die Absorption oder Transmission von Licht durch eine Probe misst. Die Analyse der Wechselwirkung einer Substanz mit Licht in verschiedenen Wellenlängen ermöglicht sowohl qualitative Aussagen über ihre chemische Zusammensetzung, als auch quantitative Bestimmungen der Konzentration der enthaltenen Moleküle.

Ein Photometer besteht im Wesentlichen aus vier Teilen: Lichtquelle

in der Regel eine Halogenlampe

, einem Monochromator, einer Küvette

Eine Küvette ist ein Gefäss mit parallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird

für die Probe und einem Detektor

Ein Detektor misst die Intensität der durch die Probe gehenden Lichtstrahlung und leitet die gemessenen Daten zur Auswertung an einen Computer weiter.

(Abbildung 2).

Abbildung 2: Aufbau eines Spektrophotometers

Der Monochromator (Prisma

Ein Prisma ist ein optisches Element aus Glas oder Quarz, das weisses Licht in seine spektralen Komponenten zerlegt.

oder optisches Gitter

Ein optisches Gitter ist eine Platte oder Folie mit sehr feinen, regelmässig angeordneten Linien (Rillen), die Licht durch Beugung und Interferenz in seine spektralen Bestandteile zerlegt. Im Spektrophotometer wird es als dispersives Element verwendet, um Licht mit einer genau definierten Wellenlänge auszuwählen. Optische Gitter bieten oft eine höhere spektrale Auflösung als Prismen und verursachen weniger optische Aberrationen.

) zerlegt das Licht und sorgt dafür, dass nur Licht einer bestimmten Wellenlänge weitergeleitet wird (d.h.: das «weisse» polychromatische Licht der Lichtquelle wird in monochromatisches Licht zerlegt) (Abbildung 3).

Wenn der Lichtstrahl durch eine Probenlösung geschickt wird, können die gelösten Substanzen einen Teil der Lichtwellen absorbieren. Der restliche Teil des Lichts wird vom Medium durchgelassen und mit Hilfe eines Detektors wird das Lichtsignal in ein elektrisches Signal umgewandelt.

Abbildung 3: Lichtbrechung durch Prisma und optische Gitter

Der lineare Bereich eines UV-Vis-Geräts

Das Gerätedesign und die Messparameter bestimmen die maximale Extinktion, die ein Gerät bei einer bestimmten Wellenlänge messen kann. Ist die Extinktion hoch, kommt nur sehr wenig Licht am Detektor an. Dies erhöht das Rauschen der Ergebnisse und im Scanmodus werden offensichtlich verrauschte Signale beobachtet (Abbildung 4).

Abbildung 4: Einfluss hoher Extinktion auf das Signalrauschen

Definiton Extinktion

In der Spektrometrie ist Extinktion ein Mass für die Abschwächung von Strahlung (wie Licht), wenn sie eine Probe durchläuft. Sie entsteht durch Absorption, Streuung und Reflexion

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Transmission und Extinktion

Es gibt zwei Möglichkeiten die Minderung der Intensität des Lichtstrahles in der Probe zu quantifizieren: die Extinktion und Transmission.

Die Transmission “T” ist das Verhältnis der Intensität des Lichtstrahls “nach” $(I)$ und “vor” $(I_0)$ Eintritt in die Probe:

Die Transmission

$$T = \frac{I}{I_0}$$

Die Transmission ist ein dimensionsloser Wert zwischen 0 und 1 (bzw. 0 % und 100 %), der angibt, welcher Anteil des einfallenden Lichts die Probe ungehindert durchdringt.

Die Extinktion $E$ ist der negative dekadische Logarithmus der Transmission bzw. der Logarithmus des Kehrwertes der Transmission:

Der Zusammenhang zwischen Extinktion und Transmission

$$E = -\log_{10}T = -\log_{10}\left(\frac{I}{I_0}\right) = \log_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right)$$

Die Extinktion ist ein dimensionsloser Wert, der angibt, wie stark das Licht durch die Probe abgeschwächt wird.

Achtung

Bei Messungen mit dem Photometer sollte versucht werden, die Extinktion unter 1 zu halten (was einer Transmission von 10 % entspricht). Bei höheren Extinktionen lässt die Probe nurnoch wenig Licht durch und die geringere Lichtmenge beeinträchtigt die Genauigkeit der Messung. Ausserdem besteht bei höheren Extinktionen die Gefahr, dass man den linearen Bereich des Geräts verlässt (siehe oben).

Umrechnung zwischen Transmission (T) und Extinktion (E)

Beispiel	Gegebener Wert	Berechnung	Ergebnis
T → E	T = 0,01 (1 %)	E = log10(1 / 0,01) = log10(100)	E = 2
T → E	T = 0,8 (80 %)	E = log10(1 / 0,8)	E ≈ 0,097
E → T	E = 2	T = 10-2	T = 0,01 (1 %)
E → T	E = 0,097	T = 10-0,097	T ≈ 0,8 (80 %)

Beispiel 1:

Berechnung der Extinktion bei einer Transmission von 1 % (= 0,01 = 1/100):

$$T = 1\% = 0,01, \quad E = ?$$$$E = \log_{10} \left( \frac{1}{0,01} \right) = \log_{10}(100) = 2$$

Beispiel 2:

Berechnung der Extinktion bei einer Transmission von 80 % (= 0,8 = 80/100):

$$T = 80\% = 0,8, \quad E = ?$$$$E = \log_{10} \left( \frac{1}{0,8} \right) = \log_{10}(1,25) \approx 0,097$$

Extinktion vs Absorption (absorbance)

Die Begriffe Extinktion und Absorption werden oft synonym verwendet, aber es gibt einen feinen Unterschied. Absorption ist ein Teil der Extinktion. Die Extinktion bezeichnet alle Prozesse, die die Lichtintensität verringern.

Definition: Extinktion...

ist ein umfassenderer Begriff, der die gesamte Abschwächung von Licht durch ein Medium beschreibt, unabhängig davon, ob diese durch Absorption, Streuung oder Reflexion verursacht wird. Sie hängt mit der Wellenlänge λ (nm) und Schichtdichte d (cm) zusammen.

Definition: Absorption

beschreibt den physikalisch-chemischen Prozess, bei dem Photonen eines elektromagnetischen Strahlungsfeldes von Molekülen aufgenommen werden. Dabei wird die Energie des Lichts auf das Molekül übertragen, meist in Form von elektronischen Anregungen, Schwingungs- oder Rotationsenergie.

In der Praxis wird die Extinktion oft gemessen, um die Konzentration einer Substanz in einer Lösung zu bestimmen, da die Absorption proportional zur Konzentration ist. Allerdings ist es wichtig zu beachten, dass die gemessene Extinktion auch durch Streuung oder Reflexion beeinflusst werden kann, insbesondere bei Suspensionen oder trüben Lösungen (Abbildung 5).

Abbildung 5: Lichtstreuung und ihre Auswirkung auf die Absorptionsmessung. Im linken Teil ist die Absorption einer Subtanz gezeigt, im mittleren Teil die Absorption aufgrund streuender Partikel. Beide überlagern sich im einfachsten Fall additiv und müssen durch geeignete Interpolation getrennt werden

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Lambert-Beer’sches Gesetz

Die quantitative Grundlage der UV/VIS-Spektroskopie bildet das Lambert-Beersche Gesetz. Es beschreibt die physikalischen Prinzipien der Lichtabsorption in Lösungen: Die Abschwächung der Lichtintensität beim Durchgang durch ein Medium ist proportional zur Konzentration der absorbierenden Substanz und zur Schichtdicke des Mediums. Das Gesetz vereint zwei Einzelgesetze: Das Lambert-Gesetz (auch Bouguer-Gesetz) beschreibt die Abhängigkeit der Absorption von der Schichtdicke, während das Beer-Gesetz den Zusammenhang zwischen Absorption und Konzentration herstellt

Die meisten gelösten Moleküle absorbieren Licht im sichtbaren oder UV-Bereich bei charakteristischen Wellenlängen. Dieser Prozess hängt von folgenden Farktoren ab:

• der Konzentration der Substanz $(c)$
• der Schichtdicke der Lösung $(d)$ (path length)
• dem spezifischen Extinktionskoeffizienten $(ε_λ)$ bei der definierten Wellenlänge

Das Lambert-Beer’sche Gesetz beschreibt diese Beziehung mathematisch als:

Definition Lambert-Beer’sche Gesetz

$$A = \varepsilon_\lambda \cdot c \cdot d$$

• A = Absorption (dimensionslos)
• ε = molarer Extinktionskoeffizient (L·mol⁻¹·cm⁻¹)
• c = Konzentration der Lösung (mol·L⁻¹)
• d = Schichtdicke der Küvette (cm)

Übungsaufgabe

• Bestimmen Sie die Konzentration von Coomassie Brilliant Blue ($CBB$) in die jeder Lösung (Glycerin, Ethanol und PBS) von Laborposten 4 - Woche 3.
• Nutzen Sie dazu die Extinktionsdaten bei 595 nm sowie die bereits berechnete Schickdike des Wells ($d$ = cm). Verwenden Sie die Molare Extinktionskoeffizienten von 43000 $M^{-1}cm^{-1}$ für $CBB$.
• Die Ergebnisse werden am Praktikumstag gemeinsam mit dem Dozenten oder Tutor diskutiert.

Gültigkeitsbedingungen des Lambert-Beer’schen Gesetzes

Damit das Lambert-Beer’sche Gesetz gültig angewendet werden kann, müssen bestimmte Bedingungen erfüllt sein:

1. Monochromatische Strahlung Die verwendete elektromagnetische Strahlung darf nur eine einzige Wellenlänge besitzen. Nur so bleibt der Zusammenhang zwischen Konzentration und Extinktion eindeutig.
2. Verdünnte Lösungen Das Gesetz gilt nur für ausreichend verdünnte Lösungen. Der lineare Zusammenhang zwischen Konzentration und Extinktion besteht nur bis zu einem bestimmten Konzentrationsbereich. Bei höheren Konzentrationen treten Abweichungen auf, verursacht durch:
   • Wechselwirkungen zwischen den absorbierenden Teilchen (z. B. Aggregation, Dissoziation)
   • Veränderungen der Wechselwirkung mit dem Lösungsmittel (z. B. geänderter Solvationsgrad)
3. Homogene Verteilung der Substanz Die gelöste Substanz muss gleichmässig in der Küvette verteilt sein. Vor jeder Messung ist daher eine gründliche Durchmischung der Lösung erforderlich.
4. Keine Lichtstreuung Die Extinktionsmessung darf nicht durch Streuprozesse verfälscht werden. Streuung kann insbesondere bei kolloidalen oder trüben Lösungen auftreten und zu falschen Messergebnissen führen.

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Molarer Extinktionskoeffizient (ε)

Der molarer Extinktionskoeffizient $ε$, auch molarer Absorptionskoeffizient genannt, ist eine stoffspezifische Konstante. Er gibt an, welche Extinktion eine 1 molare Lösung bei einer Schichtdicke von 1 cm unter definierter Wellenlänge und konstanter Temperatur aufweist.

Definition: Molarer Extinktionskoeffizient

Der molare Extinktionskoeffizient eines reinen Stoffes ist definiert als:

$\varepsilon = \frac{E}{c \cdot d}$

Einheiten:

$\varepsilon = \mathrm{M^{-1} \, cm^{-1}} = \frac{\mathrm{L}}{\mathrm{mol \cdot cm}}$

• $E$ = Extinktion
• $c$ = Konzentration der Lösung $(\mathrm{mol/L})$
• $d$ = Schichtdicke in (cm)

Achtung

• Hoher ε-Wert → starke Lichtabsorption → intensive Färbung der Lösung.
• Niedriger ε-Wert → schwache Lichtabsorption → blass gefärbte oder farblose Lösung.

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Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten (ε)

Der molare Extinktionskoeffizient wird experimentell über eine Verdünnungsreihe und Messung der Extinktion bestimmt.

1. Vorbereitung einer Verdünnungsreihe

• Mehrere Lösungen der Substanz mit bekannter Konzentration $c$ herstellen.
• Konzentrationsbereich so wählen, dass das Lambert-Beer’sche Gesetz noch linear gilt.

2. Messung der Extinktion

• Extinktion $E$ jeder Lösung bei der maximal absorbierenden Wellenlänge $λ$ messen.
• Üblicherweise wird eine Küvette mit 1 cm Schichtdicke $(d = 1\,\mathrm{cm})$ verwendet.

3. Auftragung der Messwerte

• Extinktion $E$ gegen Konzentration $c$ auftragen.
• Ergebnis sollte eine lineare Beziehung $(y = m * x + b)$ zeigen (Lambert-Beer-Gesetz).

4. Berechnung des Extinktionskoeffizienten

• Die Steigung $(m=\frac{Abs}{C})$ der linearen Ausgleichsgeraden entspricht dem Extinktionskoeffizienten:

$$$$

• Bei anderer Schichtdicke $(d \neq 1\,\mathrm{cm})$ gilt: $\varepsilon = \frac{m}{d}$

Beispiel

Abbildung 5: Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten von NADH durch Erstellung einer Standardkurve.

Lineare Beziehung lautet: $y = 64420 \cdot x + 0.0092$

$$\begin{aligned} d &= 1\,\mathrm{cm} \\[4pt] m \left( \tfrac{Abs}{C} \right) &= \frac{1}{\mathrm{M}} = 64420\,\mathrm{M^{-1}} \\[6pt] &\text{daher} \\[4pt] \varepsilon = \frac{m}{d} &= \frac{64420\,\mathrm{M^{-1}}}{1\,\mathrm{cm}} = 64420\;\frac{\mathrm{L}}{\mathrm{mol \cdot cm}} \end{aligned}$$

Küvetten

Eine Küvette ist ein Gefäss mit parallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird. In der Regel ist der Innenabstand zwischen den parallelen Seiten auf 1 cm genormt.

Die Intensität des Lichts nimmt mit der Schichtdicke der Probe exponentiell ab (Abbildung 6).

Abbildung 6: Die Extinktion E oder optische Dichte hängt von der Wellenlänge λ und der Schichtdicke d der Lösung ab. Die Intensität des Lichts nimmt mit der Schichtdicke der Probe exponentiell ab.

Die Gefässe sind aus Glas oder Kunststoff gemacht. Die Küvettenauswahl hängt vom Verwendungszweck ab (Abbildung 7).

Abbildung 7: Spektrum von verschiedenen Küvettenmaterialien im IR-, Sichtbaren- und UV Bereich. Im Vergleich zum Quarzglas haben die Kunststoffküvetten (UV-durchlässiger Kunststoff bzw. PMMA) eine höhere Extinktion im UV-Bereich und sind daher in diesem UV-Bereich nur eingeschränkt nutzbar.

Im UV-Bereich unterhalb von 200 nm müssen Quarzküvetten verwendet werden, da Kunststoffe (PMMA bzw. UV-durchlässige Kunststoffe) für Licht dieser Wellenlänge nicht transparent sind (Abbildung 8).

Abbildung 8: Spektrum von verschiedenen Küvettenmaterialien im UV-Bereich. Im Vergleich zum Quarzglas haben die Kunststoffküvetten (UV-Kunststoff bzw. PMMA) eine höhere Extinktion im UV-Bereich und sind daher in diesem UV-Bereich nur eingeschränkt nutzbar.

Abbildung 9: Verschiedene UV/VIS Kunststoffküvetten.

Schichtdicke (Pathlength)

Die Schichtdicke 𝑑 bezeichnet in der Spektrophotometrie die vertikale Ausdehnung der Lösung, durch die das Licht beim Durchtritt durch das Messgefäss hindurchgeht. Sie ist ein entscheidender Parameter, da die Absorption $A$ direkt proportional zur Schichtdicke ist (Lambert-Beer’sches Gesetz) (Abbildung 10).

Abbildung 10: Variable Schichtdicke eines Wells vs. Standardschichtdicke einer Küvette.

• $d$ wird meist in Zentimetern $(cm)$ angegeben.
• In Küvetten entspricht die Schichtdicke in der Regel der Küvettenbreite, z. B. $1 cm$.
• In Mikrotiterplatten hängt die effektive Schichtdicke von der Füllhöhe der Probe, der Geometrie des Wells und dem Meniskus-Effekt ab (Abbildung 11).

Abbildung 11: Verschiedene Lösungen können unterschiedliche Meniskusformen haben und daher unterschiedlichen Schichtdicken bei gleichem Volumen.*

Berechnung der Schichtdicke in einem Well einer Mikrotiterplatte (pathlength correction)

Die effektive $Schichtdicke$ $(d_{\text{Well}})$ in einem Well einer Mikrotiterplatte ist meist kleiner als in einer Standardküvette $(d_{\text{Küvette}} = 1\,\mathrm{cm})$ und muss für korrekte Extinktionsmessungen berücksichtigt werden.

Die Schichtdicke einer Lösung in einem Well lässt sich experimentell über die Extinktion von Wasser im nahen Infrarotbereich (NIR) bestimmen. Wasser ist im Bereich von etwa 200 nm bis 900 nm weitgehend transparent, zeigt jedoch im NIR-Bereich bei ca. 977 nm eine markante Absorptionsspitze.

Beispiel: Extinktion von Wasser

Bestimmung der Extinktion $E_{\text{H2O}}$ in einer Küvette:

Die Extinktion von Wasser bei einer definierten Wellenlänge (z. B. 977 nm) in einer Küvette mit Schichtdicke $d = 1\,\mathrm{cm}$ wird berechnet nach:

$$E_{\text{H2O}} = -\log_{10}\left(\frac{I}{I_0}\right)$$

• $I_0$= Intensität des einfallenden Lichts
• $I$ = Intensität des durch die Wasserprobe transmittierten Lichts

Die Extinktion von Wasser ($d = 1\,\mathrm{cm}$ )beträgt :

$$E_{\text{H2O}} \approx 0,18$$

Üblicherweise wird die Extinktion bei 977 nm und bei 900 nm gemessen (die Messung bei 900 nm dient dazu, die Extinktion der Mikrotiterplatte und der Probe zu korrigieren).

Für Wasser mit einer Schichtdicke von ($d = 1\,\mathrm{cm}$ ) ergeben sich folgende Werte:

$$A_{977\,\text{nm}} / d = 0,23\,\mathrm{cm^{-1}}$$$$A_{900\,\text{nm}} / d = 0,04\,\mathrm{cm^{-1}}$$$$\Delta A_{977-900\,\text{nm}} / d = 0,18\,\mathrm{cm^{-1}}$$

Die Differenz $\Delta A_{977-900\,\text{nm}}$ wird verwendet, um die effektive Schichtdicke in Mikrotiterplatten zu bestimmen und die Pathlength-Korrektur durchzuführen.

In diesem Wellenlängenbereich haben die meisten biologischen Moleküle geringe oder keine Absorption. Daher kann die gemessene Extinktion des Wassers im NIR-Bereich direkt auf die effektive Schichtdicke der wässrigen Probe zurückgerechnet werden.

Auf diese Weise lassen sich Extinktionsmessungen in Mikrotiterplatten vergleichbar zu Standardküvetten durchführen, obwohl die geometrische Höhe der Flüssigkeitssäule und der Meniskus-Effekt die effektive Schichtdicke beeinflussen.

1. Prinzip

Die Extinktion (E) ist proportional zur Schichtdicke (d):

$$E = \varepsilon \cdot c \cdot d$$

In einer Mikrotiterplatte ist d kleiner als die Standardküvettenbreite (𝑑=1cm).

2. Messung der Wasser-Referenz (Wasser bei 900 nm)

• Wasser hat bei 900 nm eine bekannte Extinktion $E_{\text{H2O}}$ in einer 1 cm Küvette (≈ 0,18).
• Die Extinktion desselben Volumens in der Mikrotiterplatte $E_{\text{Well}}$ wird gemessen.

3. Berechnung der effektiven Schichtdicke

Die effektive Schichtdicke $d_{\text{Well}}$ wird proportional berechnet:

$$d_{\text{Well}} = \frac{E_{\text{Well}}}{E_{\text{Küvette}}} \cdot d_{\text{Küvette}}$$

4. Korrektur der Messwerte Alle Extinktionswerte der Probe werden auf die Standard-Schichtdicke von 1 cm korrigiert:

$$E_{\text{kor}} = \frac{E_{\text{Probe}}}{d_{\text{Well}}} \cdot 1\,\mathrm{cm}$$

Tipp

Die Korrektur hängt von Füllvolumen, Well-Geometrie und Meniskusform ab.

Beispiel

• Extinktion von Wasser in 1 cm Küvette: $E_{\text{H2O, Küvette}} = 0,18$
• Extinktion von Wasser im Well der Mikrotiterplatte: $E_{\text{H2O, Well}} = 0,054$
• Gemessene Extinktion der Probe im Well: $E_{\text{Probe}} = 0,32$

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1. Berechnung der effektiven Schichtdicke

$$$$$$d_{\text{Well}} = \frac{0,054}{0,18} \cdot 1\,\mathrm{cm} = 0,30\,\mathrm{cm}$$

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2. Korrektur der Probenextinktion

$$E_{\text{kor}} = \frac{E_{\text{Probe}}}{d_{\text{Well}}} \cdot 1\,\mathrm{cm}$$$$E_{\text{kor}} = \frac{0,32}{0,30} \cdot 1\,\mathrm{cm} \approx 1,067$$

Die korrigierte Extinktion für die Probe bei einer Schichtdicke von 1 cm beträgt etwa 1,067. Diese Extinktion kann nun direkt für die Konzentrationsbestimmung mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz verwendet werden.

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Anwendungen der Spektrophotometrie

• Quantitative Analyse von Lösungen: Bestimmung der Konzentration von Ionen, Molekülen oder Farbstoffen. Beispiel: Messung der Vit B12-Konzentration in Lebensmitteln.
• Überwachung chemischer Reaktionen: Verfolgung des Reaktionsfortschritts durch Messung der Absorption bei charakteristischer Wellenlänge. Beispiel: Enzymatische Reaktionen oder Kinetikstudien.
• Identifikation von Substanzen: Bestimmung charakteristischer Absorptionsspektren zur Identifikation von Molekülen oder funktionellen Gruppen. Beispiel: UV-Vis-Spektroskopie DNA bzw. Protein .
• Reinigungs- und Qualitätskontrolle: Kontrolle der Reinheit von Chemikalien oder pharmazeutischen Präparaten. Beispiel: Analyse von Verunreinigungen in Trinkwasser oder Medikamenten.
• Studium von Molekülinteraktionen: Untersuchung von Bindungen oder Komplexbildungen. Beispiel: Protein-Ligand-Interaktionen über Änderungen im Absorptionsspektrum.
• Umweltanalytik: Messung von Schadstoffen wie Nitrat, Nitrit oder Schwermetallen in Wasserproben.

Bedienungsanleitung für das UV/Vis-Spektrophotometer

Vorbereitung

1. Gerät einschalten Spektrophotometer einschalten und einige Minuten vorwärmen lassen, falls vom Hersteller empfohlen.
2. Wellenlänge einstellen Die gewünschte Messwellenlänge einstellen (z. B. 280 nm für Proteine oder 595 nm bei Bradford-Assay).
3. Küvetten vorbereiten
   • Saubere, klare Glas- oder Kunststoffküvetten sollen verwendet werden.
   • Die Aussenseite der Küvette muss mit einem fusselfreien Tuch sauber abgewischt werden (z. B. Kimwipes).
   • Küvetten nur an den matten Seiten anfassen – nie an den klaren Messflächen.

Blank-Messung (Nullabgleich)

4. Blanklösung einfüllen
   Befüllen der Küvette mit der Leer- oder Referenzlösung (z. B. Wasser, Reagenz ohne Analyt oder Pufferlösung). Luftblasen in der Küvette sollen vermieden werden – sie können die Messung stark verfälschen.
5. Küvette einsetzen
   Die Küvette wird in das Spektrophotometer eingesetzt und darauf achten, dass die 1 cm Schichtdicke entlang des Lichtstrahls ausgerichtet ist.
6. Null setzen
   Durch Drücken der Taste für „Zero“, „Blank“ oder „Tara“, wird die Absorption auf 0,000 gesetzt. Diese Referenz wird für alle weiteren Proben verwendet.

Details

Blank oder Blindprobe

Ein Blank (oder Blindprobe) ist eine Lösung, die alle Komponenten der Probe enthält ausser dem zu messenden Analyten. Sie dient dazu, die Eigenabsorption des Lösungsmittels, der Reagenzien und der Küvette zu erfassen. Durch Messung des Blanks kann das Spektrophotometer auf Null gestellt werden, sodass nur die Absorption der eigentlichen Probe erfasst wird.

Die Blindprobe wird verwendet um:

• Hintergrundabsorption und Störsignale zu eliminieren.
• den Nullpunkt (Basisline) der Messung zu definieren.
• sicherzustellen, dass die gemessene Absorption ausschliesslich vom Analyten stammt.

Probenmessung

7. Probe einfüllen
   Befüllung der Küvette mit der Probe (z. B. Reagenz plus Proteinlösung) unter Beachtung, dass keine Luftblasen entstehen, da diese die Absorptionsmessung stark verfälschen können.
8. Küvette einsetzen und messen
   Setzen Sie die Küvette wie zuvor in das Gerät ein und notieren Sie die Absorption.

warnung

⚠️ Stellen Sie sicher, dass die 1 cm-Schichtdicke korrekt in Richtung des Lichtstrahls ausgerichtet ist.

9. Wiederholung des Messvorgangs
   Die Schritte 7–8 werden für alle weiteren Proben oder Standardlösungen wiederholt.

Datenauswertung

10. Daten auswerten
    • Die Absorptionswerte $(y)$ und Konzentrationen $(x)$ in einem Diagramm eingetragen (bei Standardkurve).
    • Die Konzentrationen unbekannter Proben werden entweder über die Standardkurve oder mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz berechnet.

Nachbereitung

11. Küvetten reinigen
    Die Quarz-Küvetten werden gründlich mit destilliertem Wasser und Ethanol gereinigt und an der Luft trocknen gelassen oder mit Druckluft getrocknet. Einwegküvetten sollten nach dem Entleeren fachgerecht entsorgt werden.

12. Gerät ausschalten
    Das Spektrophotometer wird ausgeschaltet und ggf. abgedeckt.

Quantitative und qualitative Analyse

Drei wesentliche Methoden spielen dabei eine zentrale Rolle:

1- Spektrum Das Absorptionsspektrum ist das „fingerprintartige“ Diagramm der Lichtaufnahme einer Substanz über verschiedene Wellenlängen.

• Jedes Molekül absorbiert Licht charakteristischer Wellenlängen im UV- oder sichtbaren Bereich.
• Durch Aufnahme eines Absorptionsspektrums kann die Wellenlänge identifiziert werden, bei der die Substanz am stärksten absorbiert (Maximum der Absorption, $λ_{max}$).

2- Lambert-Beer’sches Gesetz

• Beschreibt den Zusammenhang zwischen der Absorption und Konzentration
• Das Gesetz gilt im linearen Bereich, in dem die Absorption direkt proportional zur Konzentration ist.

3- Standardkurve

Eine Standardkurve ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der bekannten Konzentration einer Substanz und einem messbaren Signal (z. B. Extinktion) darstellt. Sie dient dazu, die Konzentration unbekannter Proben zu bestimmen.

• Zur praktischen Bestimmung unbekannter Konzentrationen werden Lösungen bekannter Konzentration gemessen.
• Die gemessenen Absorptionen werden gegen die Konzentration aufgetragen, wodurch eine Standardkurve entsteht.
• Die Konzentration unbekannter Proben kann dann anhand dieser Kalibrierkurve bestimmt werden.

Linearer Bereich

Der Bereich, in dem das Signal proportional zur Konzentration ist. Ausserhalb dieses Bereichs gilt das Lambert-Beer’sche Gesetz nicht mehr.

Absorptionsspektrum von Makromolekülen

Da DNA und Proteine Absorptionsmaxima bei verschiedenen Wellenlängen aufweisen, können sie photometrisch unterschieden werden. Dazu eignet sich ein Spektrum von 210 bis 350 nm (Quarzküvetten) bzw. von 230 bis 350 nm bei der Verwendung von UV-Plastikküvetten. DNA weist ein Absorptionsmaximum bei 260 nm und Proteine bei 280 nm auf. Oberhalb von 325 nm absorbieren weder DNA noch Proteine. Bei dieser Wellenlänge gemessene Extinktionen sind auf Verunreinigungen, auf Lichtstreuung oder in seltenen Fällen auf farbige Proteine (z.B. Hämoglobin) zurückzuführen.

Nukleinsäurelösung

Eine Nukleinsäurelösung zeigt ein typisches UV-Absorptionsspektrum mit einem Maximum bei 260 nm. Die aromatischen Basen der Nukleinsäuren sind für die Absorption bei dieser Wellenlänge verantwortlich. Messungen im UV-Bereich können jedoch durch weitere Substanzen in der Probe verfälscht werden. Die Reinheit einer Nukleinsäure Probe kann durch die zusätzliche Messung der Absorption bei 230 nm (Detektion organischer Substanzen) und 280 nm(Detektion von Proteinen und Phenolen) ermitteln werden. Für eine reine DNA-Probe sollten die Absorptionsverhältnisse bei den Wellenlängen von 260 zu 280 nm bzw. 260 zu 230 nm folgende Werte erhalten werden:

$A_{260}/A_{280} \approx 1.8\text{–}2.0$

$A_{260}/A_{230} \ge 2.0$

Bestimmung der DNA-Konzentration durch Absorptionsmessung

Die Konzentration von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in einer Lösung kann photometrisch bestimmt werden. Die Messung wird in einer Quarzküvette oder in einer UV-Mikrotiterplatte bei einer Wellenlänge von 260 nm durchgeführt. Aus der Absorption der Lösung kann die Konzentration anhand des folgenden Verhältnisses berechnet werden:

A260	Konzentration	Substanz	Kommentar
1	50 µg/mL	DNA (ds)	Doppelsträngige DNA
1	33 µg/mL	DNA (ss)	Einzelsträngige DNA
1	40 µg/mL	RNA	Ribonukleinsäure

Tabelle 2: Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren aus der Absorption bei 260 nm

Tipp

Die Gleichungen gelten für Nukleinsäuren bei pH 7.0 in einem Puffer mit geringer Salzkonzentration.

Proteine

Bestimmung der Protein-Konzentration durch Absorptionsmessung

Eine Proteinlösung zeigt ein charakteristisches UV-Absorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm. Diese Absorption wird hauptsächlich durch die aromatischen Aminosäuren Tyrosin (Tyr, Y), Tryptophan (Trp, W) und Phenylalanin (Phe, F) sowie durch Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten verursacht. Messungen im UV-Bereich können jedoch durch andere in der Probe enthaltene Substanzen beeinflusst werden. Um die Reinheit einer Proteinprobe zu überprüfen, wird zusätzlich die Absorption bei 260 nm, einem typischen Signalbereich für Nukleinsäuren, gemessen.

Ein Absorptionsverhältnis (A260/A280) von etwa 0,57 weist auf eine reine Proteinlösung hin, da ein höherer Wert auf Verunreinigungen durch Nukleinsäuren schliessen lässt. Abhängig von der Reinheit der Probe können die Messdaten auf zwei Arten ausgewertet werden:

• Bei reinen Proteinlösungen erfolgt die Konzentrationsbestimmung nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz.
• Ist die Proteinprobe mit DNA kontaminiert, empfiehlt sich die Auswertung nach der Methode von Layne, die eine Korrektur für die Nukleinsäureanteile beinhaltet.

Methode nach Lambert-Beer

Die Messung der UV-Absorption bei 280 nm wird empfohlen für die Konzentrations-bestimmung von reinen Proteinen. Hierzu wird der molare Extinktionskoeffizient des Proteins benötigt

$$\varepsilon_{280\,\mathrm{nm}} \approx 5500\,\mathrm{M^{-1}\,cm^{-1}}\cdot n_{\mathrm{Trp}} + 1490\,\mathrm{M^{-1}\,cm^{-1}}\cdot n_{\mathrm{Tyr}}$$

der sich in erster Näherung über die Anzahl der Tyrosine und Tryptophane des Proteins bestimmen lässt.

Formel: Proteinkonzentration nach Lambert-Beer

$$\text{Proteinkonzentration} \, (P) = \frac{A_{280\,\text{nm}}}{\varepsilon_{280\,\text{nm}} \cdot d}$$

Konzentrationsbestimmung eines reinen Proteins aus der Absorption bei 280 nm.

Bei Oligonukleotiden mit bekannter Sequenz wird die Konzentration über das Lambert-Beer’sche Gesetz mit Hilfe der molaren Extinktionskoeffizienten der einzelnen Nukleotide berechnet.

Der molare Absorptionskoeffizient eines Proteins bei 280 nm kann mit ausreichender Genauigkeit aus dem Gehalt an Tyrosin, Tryptophan sowie dem Anteil an Disulfidbrücken und ihren jeweiligen Absorptionskoeffizienten berechnet werden:

Formel: Molarer Extinktionskoeffizient eines Proteins bei 280 nm

$$\varepsilon_{280nm} = 5500 \, \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1} \cdot n_{\text{Trp}} + 1490 \, \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1} \cdot n_{\text{Tyr}} + 125 \, \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1} \cdot n_{\text{SS}}$$

Dabei gilt:

• $n_{\text{Trp}}$ : Anzahl der Tryptophan-Reste pro Proteinmolekül
• $n_{\text{Tyr}}$ : Anzahl der Tyrosin-Reste pro Proteinmolekül
• $n_{\text{SS}}$ : Anzahl der Disulfidbrücken pro Proteinmolekül

Bei einem Proteingemisch wird die Gesamtproteinkonzentration in einer Annäherung wie folgt berechnet:

Formel: Proteinkonzentration eines Proteingemischs bei 280 nm

$$\text{Proteinkonzentration} = \frac{A_{280\,\text{nm}}}{(1\,\mathrm{mL/mg\,cm}) \cdot d}$$

• $A_{280\,\text{nm}}$ = gemessene Extinktion bei 280 nm
• $d$ = Schichtdicke der Küvette (pathlength)

Konzentrationsbestimmung bei einem Proteingemisch aus der Absorption bei 280 nm

Faustregel

Eine wichtige Faustregel für die Bestimmung der Proteinkonzentration lautet:

Bei einer Extinktion von $1$ bei $280 nm$ und einer Schichtdicke von $1 cm$ liegt die Proteinkonzentration bei $1 \text{mg/mL}$.

Das setzt voraus, dass die Proteinmischung eine durchschnittliche Anzahl von Tyrosin und Tryptophan enthält.

Methode nach Layne

Häufig enthalten Proteingemische noch geringe Mengen von Nukleinsäuren und Nukleotiden, die aber das UV-Licht wesentlich stärker absorbieren (0.05 mg/mL DNA bewirken eine UV-Absorption von 1 bei 260 nm und 0.5 bei 280 nm). Bei einer Verunreinigung einer Proteinprobe (wenn also $A260/A280$ > $0.57$) werden die folgenden Näherungsgleichungen verwendet, um die Proteinkonzentration zu bestimmen:

Definition: Proteinkonzentration nach Layne

$$\text{Proteinkonzentration} = \frac{1.55 \cdot A_{280} - 0.76 \cdot A_{260}}{d} \cdot 1\,\mathrm{\frac{mg}{mL \cdot cm}}$$

Bei dieser Näherung wird versucht den Beitrag von Nukleinsäuren bei der Absorption bei 280 nm durch die Bestimmung der Absorption bei 260 und 280 nm zu berechnen und in Abzug zu bringen.

Kolorimetrische Methode

Die kolorimetrische Methode ist ein analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Stoffes in Lösung anhand seiner Lichtabsorption. Dabei wird entweder die spezifische Absorption der Substanz selbst genutzt oder ein Reagenz eingesetzt, das mit dem Analyten reagiert und eine farbige Verbindung bildet. Die Intensität der entstandenen Farbe (gemessen als Absorption bei einer definierten Wellenlänge) ist direkt proportional zur Konzentration des gesuchten Stoffes.

Die Auswertung der kolorimetrischen Methode kann auf zwei Arten erfolgen:

1. Lambert-Beer’sches Gesetz:
   Wenn der molare Absorptionskoeffizient ε bekannt ist, kann die Konzentration des Analyten direkt aus der gemessenen Absorption berechnet werden:

$$$$

Diese Methode eignet sich besonders für reine Substanzen mit definierter chemischer Struktur und bekanntem Extinktionskoeffizienten, z. B. bei reinen Proteinlösungen, Vitaminlösung, etc.

2. Standardkurve (Kalibrierkurve):
   Ist der Extinktionskoeffizient nicht bekannt – etwa bei komplexen Mischungen oder bei Einsatz eines Farbreagenzes (z. B. Bradford, BCA) – wird die Konzentration mithilfe einer Standardkurve ermittelt. Diese basiert auf der Messung von Proben mit bekannten Konzentrationen und der Auftragung von Absorption gegen Konzentration.

   Diese Methode ist besonders geeignet für biologische Proben mit unbekanntem oder variierendem Absorptionsverhalten.

In der Praxis wird häufig die Standardkurvenmethode bevorzugt, da sie robust gegenüber Matrixeffekten und Schwankungen im Farbreagenz ist.

Standardkurve

Eine Standardkurve (auch Kalibrierkurve genannt) ist eine grafische Darstellung, die den Zusammenhang zwischen der Absorption (y-Achsen) und der Konzentration einer Substanz (x-Achsen) beschreibt. Sie wird erstellt, indem mehrere Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen gemessen und ihre Absorptionswerte aufgezeichnet werden. Durch Auftragung dieser Werte entsteht in der Regel eine lineare Kurve, die anschliessend als Referenz zur Bestimmung der Konzentration unbekannter Proben dient.

Der Einsatz einer Standardkurve ist besonders dann sinnvoll, wenn:

• der Extinktionskoeffizient (ε) der Substanz nicht bekannt oder nicht konstant ist (z. B. bei Proteingemischen oder biologischen Proben),
• ein Farbreagenz verwendet wird (z. B. bei Bradford-, BCA- oder Lowry-Assays),
• eine hohe Genauigkeit bei der Konzentrationsbestimmung erforderlich ist.

Vorgehen:

1. Vorbereitung einer Reihe von Standardlösungen mit definierter Konzentration (Verdünnungsreihe).
2. Messung der Absorption jeder Lösung bei der relevanten Wellenlänge.
3. Auftragung der Absorption gegen die Konzentration in einem Diagramm.
4. Lineare Regression zur Bestimmung der Geradengleichung: $$y = m \cdot c + b$$
5. Berechnung der unbekannten Konzentration in einer Probe anhand der gemessenen Absorption und der Kalibriergeraden. $x = \frac{y - b}{m}$

Tipp

Die Standardkurve dient als Referenz, um die Konzentration unbekannter Proben zuverlässig zu bestimmen.

Beispiel: Erstellung und Auswertung einer Standardkurve in Excel

Schritt-für-Schritt-Anleitung:

1. Daten erfassen

   • Tragen Sie die Konzentrationen der Standards (x-Werte) in eine Spalte ein.
   • Erfassen Sie die gemessenen Absorptionswerte (y-Werte) in einer benachbarten Spalte.

2. Streudiagramm erstellen

   • Markieren Sie beide Spalten.
   • Wählen Sie in Excel Einfügen → Punkt (XY)-Diagramm → Punkte mit nur Markierungen.

3. Trendlinie hinzufügen

   • Klicken Sie auf die Datenpunkte im Diagramm.
   • Wählen Sie Trendlinie hinzufügen.
   • Wählen Sie den Typ linear.
   • Aktivieren Sie die Optionen:
     • Gleichung im Diagramm anzeigen
     • Bestimmtheitsmaß (R²) im Diagramm anzeigen

4. Linearen Bereich bestimmen

   • Prüfen Sie, welche Datenpunkte im linearen Bereich liegen.
   • Entfernen Sie ggf. Werte außerhalb der Linearität (z. B. sehr hohe Konzentrationen).
   • Wiederholen Sie die Trendlinienberechnung nur mit den linearen Werten.

5. Geradengleichung verwenden

   • Die Gleichung lautet: $y = m \cdot x + b$
   • Um die Konzentration $x$ einer Probe zu berechnen, wird die Formel nach $x$ umgestellt: $x = \frac{y - b}{m}$

6. Kontrolle der Qualität der Standardkurve

   Hinweis: Eine gute Standardkurve sollte ein Bestimmtheitsmaß
   $(R^2)$ im Bereich von 0,998 bis 1 aufweisen.
   Werte unterhalb dieses Bereichs deuten auf Abweichungen von der Linearität oder mögliche Messfehler hin.

7. Probenberechnung

   • Setzen Sie die gemessenen Absorptionswerte der Proben in die Geradengleichung ein.
   • Berechnen Sie daraus die Konzentration.
   • Wichtig: Falls die Proben vor der Messung verdünnt wurden, muss der Verdünnungsfaktor berücksichtigt werden.

Quiz: Spektrophotometrie

Welche Voraussetzung muss erfüllt sein, damit das Lambert-Beer’sche Gesetz gilt?

Was beschreibt das Lambert-Beer’sche Gesetz?

Wie kann experimentell überprüft werden, ob das Lambert-Beer’sche Gesetz im gewählten Konzentrationsbereich gültig ist?

Was beschreibt der molare Extinktionskoeffizient (ε)?

Welche Einheit hat der molare Extinktionskoeffizient (ε)?

Welche Aussage beschreibt die Funktionsweise eines Spektrophotometers korrekt?

Welche Fehlerquelle kann zu einer falschen Absorption führen?

Warum sollte die Küvette bei wiederholten Messungen immer gleich ausgerichtet sein?

Welche Aussage zur Reinheit von Nukleinsäurelösungen ist richtig?

Warum absorbieren Proteine typischerweise bei 280 nm?

Spektrophotometrie: Fachrechnen Aufgaben mit Lösungen

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Frage 1: Lambert-Beer’sches Gesetz
Eine Lösung einer Substanz hat eine Konzentration von c = 0,0020 mol/L. Bei 450 nm beträgt der molare Extinktionskoeffizient ε = 1200 L·mol⁻¹·cm⁻¹. Das Licht durchläuft eine Küvette der Länge d = 1 cm.
Berechne die Absorption $A$ der Lösung.

Lösung anzeigen

$$A = \varepsilon \cdot c \cdot d$$$$A = 1200 \cdot 0,020 \cdot 1$$$$A = 2,4 \quad \text{(dimensionlos)}$$

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Frage 2: Konzentration aus gemessener Absorption
Eine Lösung zeigt bei 520 nm eine Absorption von A = 0,85. Die Küvette ist 1 cm lang, und der molare Extinktionskoeffizient beträgt ε = 2500 L·mol⁻¹·cm⁻¹.
Berechne die Konzentration $c$.

Lösung anzeigen

$$c = \frac{A}{\varepsilon \cdot d}$$$$c = \frac{0,85}{2500 \cdot 1}$$$$c = 0,00034 \text{ mol/L } = 3,4 \cdot 10^{-4} \text{ mol/L}$$

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Frage 3: Transmittanz berechnen
Licht durchläuft eine Lösung mit einer Absorption von A = 0,60.
Berechne die Transmittanz $T$ in Prozent.

Lösung anzeigen

$$T = 10^{-A}$$$$T = 10^{-0,60} \approx 0,2512$$$$T(\%) = 0,2512 \cdot 100 \approx 25,1\%$$

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Frage 4: Molarer Extinktionskoeffizient
Eine Lösung von c = 0,010 mol/L absorbiert bei 400 nm A = 0,45. Die Küvette hat eine Länge von d = 1 cm.
Berechne den molaren Extinktionskoeffizienten $ε$.

Lösung anzeigen

$$ε = \frac{A}{c \cdot d}$$$$ε = \frac{0,45}{0,010 \cdot 1}$$$$ε = 45\,\,\text{L}·\text{mol⁻¹}·\text{cm⁻¹}$$

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Frage 5: Verdünnungsrechnung mit Absorption
Eine konzentrierte Lösung zeigt bei 600 nm A = 1,20 in einer 1 cm Küvette. Du möchtest eine Lösung herstellen, deren Absorption A = 0,30 beträgt.
Mit welchem Verdünnungsfaktor muss die Lösung verdünnt werden?

Lösung anzeigen

$$\frac{A_1}{A_2} = \frac{c_1}{c_2} = \text{Verdünnungsfaktor}$$$$\text{Verdünnungsfaktor} = \frac{1,20}{0,30} = 4$$

Die Lösung muss also 1:4 verdünnt werden (1 Teil Lösung + 3 Teile Lösungsmittel), um eine Absorption von 0,3 zu erhalten.