Woche 3 — Laborpipetten
Einleitung
In dieser Woche werden wir uns mit grundlegenden Pipettiertechniken und den verschiedenen Pipetten-Arten beschäftigen. Wir werden ein grundlegendes Verständnis für diese wichtigen Verfahren entwickeln und die korrekte Verwendung von Mikropipetten, Vollpipetten und anderen Pipetten-Arten üben.
- Sie kennen die verschiedenen Laborpipetten-Arten und deren entsprechende Genauigkeit (Kolbenhubpipette, Stabpipette, Vollpipette usw.).
- Sie kennen die Begriffe Justierung In/Ex.
- Sie können Pipetten korrekt handhaben.
- Sie können den Meniskus korrekt ablesen.
- Sie kennen die Faktoren, die die Genauigkeit der Flüssigkeitsmessung beeinflussen.
- Sie kennen die unterschiedlichen Pipettierhilfen und deren Verwendung (manuell und elektronisch).
Laborpipetten
Eine Pipette ist ein wichtiges Laborwerkzeug, das zum Abmessen, Aufnehmen und Abgeben definierter Flüssigkeitsvolumina verwendet wird. Ein korrektes Verständnis der Pipettierarten und deren Justierungsarten ist entscheidend für exakte und reproduzierbare Messergebnisse.
Geschichte: Heinrich Schnitger und die Entwicklung der Kolbenhubpipette
Heinrich Schnitger (1925–1964), ein deutscher Mediziner, entwickelte in den 1950er-Jahren die erste Kolbenhubpipette. Sein Ziel war es, die ungenauen und gesundheitsschädlichen Methoden des Flüssigkeitstransfers im Labor – bei denen man Flüssigkeiten oft mit dem Mund in Pipetten ansaugte – zu ersetzen.
Sein Prototyp von 1957 basierte auf einer modifizierten Metallspritze mit Federmechanismus, Luftpolster und abnehmbarer Kunststoffspitze – viele Merkmale, die bis heute üblich sind.
Später erwarb die Firma Eppendorf die Lizenz zur Herstellung und entwickelte seine Erfindung weiter zu den Mikropipetten, die heute weltweit in Laboren verwendet werden.
When a common problem meets an ingenious mind. EMBO Reports, 6(9): 797–800, October 2005. DOI: 10.1038/sj.embor.7400520
Pipettenarten im Labor
Es gibt viele verschiedene Arten von Pipetten, die jeweils für unterschiedliche Anwendungen konzipiert sind. Zwei der gängigsten Pipettentypen sind Vollpipetten und Messpipetten. Beide dienen dem Abmessen und Übertragen kleiner, messbarer Flüssigkeitsvolumina, unterscheiden sich jedoch in ihrer Genauigkeit, Skalierung und Volumenkapazität.
| Pipettenart | Volumenbereich | Skala | Genauigkeit | Justierung | Anwendung |
|---|---|---|---|---|---|
| Vollpipette | 1–100 ml | keine Skala, nur ein Volumen | sehr hoch | Ex | Ein bestimmtes, definiertes Volumen |
| Messpipette | 0,1–50 ml | graduierte Skala | hoch | Ex | Flexibles Abmessen verschiedener Volumina |
| Mikropipette | 0,1 µl – 1000 µl | Digital/Mechanisch einstellbar | hoch | Ex | Präzise Abmessung von kleinen Volumina |
| Pasteurpipette | ungefähr <5 ml | keine | niedrig | keine Eichung | Tropfenweise Abgabe |
| Dispenser | je nach Modell (10 µl–5 ml) | Digital/Mechanisch einstellbar | sehr hoch | Ex | Wiederholte Abgabe gleicher Volumina |
Tabelle 1: Pipettenmerkmale
Justierung von Pipetten
Die Justierung, auch Kalibrierung genannt, beschreibt, wie das angegebene Volumen gemessen bzw. abgegeben wird. Es gibt zwei Hauptarten von Justierung “In” und “Ex”.
“In” (Inklusive - auf Inhalt) bedeutet, dass das gesamte Volumen inklusive des Resttropfens zum gesamte Volumen zählt. Die Pipette muss vollständig entleert werden.
“Ex” (Exklusive - auf Ablauf) bedeutet, dass nur das angegebene Volumen zählt. Nach dem Ablauf bleibt immer ein kleiner Flüssigkeitsrest in der Pipette. Das Restvolumen muss nicht abgegeben werden!
Allgemeine Regeln zur Handhabung
Die präzise Anwendung von Pipetten ist eine Grundvoraussetzung für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Eine korrekte Handhabung erfasst nicht nur das exakte Ablesen des Meniskus
(die gekrümmte Oberfläche der Flüssigkeit, die exakt auf Augenhöhe abgelesen werden muss, um Parallaxefehler zu vermeiden) und das senkrechte Halten der Pipette, sondern auch das Aufnehmen und Abgeben der Flüssigkeit.
Zudem spielen Faktoren wie Temperatur, Viskosität der Flüssigkeit, die Wahl der richtigen Pipettenart sowie
Justierung(In/Ex) nach ISO Norm eine wichtige Rolle, welche die Genauigkeit der Messung erheblich beeinflussen.
Um eine Pipette richtig zu verwenden, ist es wichtig, die Flüssigkeit gleichmässig aufzuziehen und abzugeben, während die Pipette senkrecht gehalten wird. Tauchen Sie die Spitze dabei richtig in die Flüssigkeit ein und ziehen Sie die Flüssigkeit langsam auf, um Luftblasen zu vermeiden. Beim Abgeben sollte die Pipettenspitze die Gefässwand leicht berühren.
Der Begriff Parallax stammt aus dem Griechischen „Parallaxis“ und bedeutet „Veränderung“. Er beschreibt die scheinbare Verschiebung eines Objekts, die auftritt, wenn es aus unterschiedlichen Blickwinkeln betrachtet wird. Ein Parallaxefehler beim Ablesen von Flüssigkeitsvolumen tritt auf, wenn die Skala nicht genau senkrecht oder auf Augenhöhe betrachtet wird.
Anleitung zum richtigen Pipettieren mit Voll- und Messpipette
1. Vorbereitung:
- saubere und unbeschädigte Messpipette mit geeignetem Volumen wählen
- passende Pipettierhilfe (z. B. Pipettierball, elektrische Pipettierhilfe) verwenden
- Flüssigkeit und Pipette sollten Raumtemperatur haben
- Pipette gegebenenfalls 2–3× mit der zu pipettierenden Flüssigkeit vorspülen
2. Flüssigkeit aufziehen:
- Pipette in die Pipettierhilfe stecken und sicher befestigen
- Zu tiefes Eintauchen kann dazu führen, dass mehr Flüssigkeit als gewollt aufgenommen wird, weil zusätzliche Tropfen an der Aussenseite der Spitze hängen bleiben.
- Flüssigkeit etwas über den gewünschten Messstrich aufziehen
- Pipette vorsichtig aus dem Gefäss ziehen, ohne Flüssigkeit zu verlieren
3. Volumen einstellen:
- Pipette senkrecht halten, auf Augenhöhe bringen
- Flüssigkeit langsam bis zum gewünschten Messstrich ablaufen lassen
- Volumenstrich am unteren Rand des Meniskus ablesen
4. Flüssigkeit abziehen:
- Zielgefäss leicht schräg halten
- Pipettenspitze an die Innenwand des Gefässes führen
- Pipette senkrecht halten, Flüssigkeit ablaufen lassen
- Warten (ca. 15 Sekunden), um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit abgeflossen ist
- Justierung der Pipette berücksichtigen
5. Nachbereitung:
- Restflüssigkeit fachgerecht entsorgen
- Pipette gemäss den Laborrichtlinien reinigen und spülen
- Pipette senkrecht in einem Pipettenständer mit der Spitze nach unten lagern
Für optimale Ergebnisse:
- Das Volumen sollte stets auf Augenhöhe abgelesen werden, um Parallaxefehler zu vermeiden.
- Die Spitze der Pipette nur so weit in die Flüssigkeit eintauchen, wie nötig, also knapp unter die Oberfläche.
- Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Viskositäten mit angepassten Geschwindigkeiten pipettieren, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten.
- Vermeide Temperaturschwankungen durch Handwärme oder ungleich temperierte Flüssigkeiten.
- Verwende für schäumende oder viskose Flüssigkeiten bei Bedarf eine alternative Pipettiertechnik (z. B. Rückwärtspipettieren mit Kolbenhubpipette).
Um einen Meniskus in einer Voll- oder Messpipette genau abzulesen, muss man seine Augen auf Höhe des Flüssigkeitsspiegels bringen und den tiefsten Punkt des Meniskus (die U-förmige Krümmung bei Wasser und den meisten Flüssigkeiten) mit der Skala des Geräts abgleichen.
Anleitung zum richtigen Pipettieren mit Kolbenhubpipetten
Kolbenhubpipetten (Air-Displacement-Pipetten) ermöglichen das präzise Dosieren kleiner Flüssigkeitsvolumina. Die Genauigkeit beim Pipettieren wird massgeblich durch die Haltung, die Auswahl des geeigneten Geräts, sowie die Anwendung der passenden Pipettiertechnik beeinflusst.
Perfektioniere deine Pipettiertechnik – Fisher Scientific
Beim Pipettieren die Pipette senkrecht (90°) halten, um Luftblasen zu vermeiden und das Ansaugen gleichmässig zu gestalten.
Beim Pipettieren sollte die Pipettenspitze nur wenige Millimeter (2–3 mm bei kleinen Volumina, max. 5–6 mm bei grösseren) in die Flüssigkeit eingetaucht werden – und nicht zu tief.
Schritte zur korrekten Handhabung von Pipetten:
1. Vorbereitung
- Pipette und passende Pipettenspitze für das gewünschte Volumen wählen.
- Pipette und Flüssigkeit akklimatisieren: Pipette, Spitzen und Flüssigkeit sollten auf die gleiche Temperatur gebracht werden, um Messfehler zu vermeiden.
- Pre-Wetting-Methode: Pipettenspitze mit der gewünschten Flüssigkeit benetzen.
- Volumen einstellen: Das gewünschte Volumen an der Pipette einstellen.
2. Flüssigkeit aufziehen
- Pipette senkrecht halten: Die Pipette senkrecht zur Flüssigkeit ausrichten (maximal 10° Abweichung).
- Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken (Vorwärts-pipettieren)
- Eintauchtiefe beachten: Die Pipettenspitze 2-3 mm tief in die Flüssigkeit eintauchen, bei grösseren Volumina bis zu 6 mm.
- Kolben langsam bewegen: Den Kolben langsam und gleichmässig nach oben bewegen, um die Flüssigkeit aufzuziehen.
- Kurz warten: Nach dem Aufziehen kurz warten, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit vollständig in die Spitze gelangt ist.
3. Flüssigkeit abgeben
- Pipettenspitze an der Innenwand des Zielgefässes im richtigen Winkel halten: Die Pipette beim Abgeben der Flüssigkeit in einem Winkel von 45° halten.
- Kolben langsam bis zum ersten Druckpunkt drücken und kurz warten, dann wird der Kolben bis zum zweiten Druckpunkt gedrückt, um die Restmenge abzugeben.
- Spitze beim gedrückten Kolben aus dem Gefäss ziehen und die gebrauchte Pipettenspitze mit dem Auswurfsystem entfernen und fachgerecht entsorgen.
Immer innerhalb des empfohlenen Volumenbereichs der Pipette (normalerweise 35-100% des Maximalvolumens) arbeiten.
Pre-Wetting
Das Pre-Wetting der Pipettenspitze ist eine einfache, aber effektive Methode, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit beim Pipettieren, insbesondere bei flüchtigen oder viskosen Flüssigkeiten, zu verbessern.
Durch das Vorbenetzen wird die Innenwand der Spitze gleichmässig befeuchtet, wodurch Verdunstungsverluste sowie Volumenschwankungen reduziert werden. Die Technik besteht darin, die Pipettenspitzen vor dem eigentlichen Pipettiervorgang mehrmals mit der zu pipettierenden Flüssigkeit zu befüllen und wieder zu entleeren. So wird die Spitze effektiv vorgefeuchtet.
Ablauf der Pre-Wetting-Technik
- Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken.
- Pipettenspitze senkrecht in die Flüssigkeit halten (90°), in die Flüssigkeit tauchen (Achtung NUR die Spitze)
- Kolben langsam loslassen, dabei wird das gewünschte Volumen angesaugt.
- Flüssigkeit abgeben: Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken, dabei wird die Flüssigkeit vollständig wieder in das Ursprungsgefäss zurückzurückgegeben.
- Schritte 3 und 4 mehrmals wiederholen (2-3 Mal), dabei wird die Innenwand der Spitze mit der Flüssigkeit benetzt.
- Nun kann die Flüssigkeit wie gewohnt aufgezogen und abgegeben werden.
Wird unterhalb von 35 % pipettiert, nimmt der Anteil an «toter Luft» im System deutlich zu. Dadurch steigt das Risiko für ungenaues und unpräzises Pipettieren.
Vorwärtspipettieren (Forward Pipetting)
Diese Technik wird empfohlen für das Pipettieren wässriger, nicht-viskoser Flüssigkeiten.
Beim Vorwärtspipettieren wird das gewünschte Flüssigkeitvolumen in die Pipettenspitze aufgenommen, indem der Kolben bis zum ersten Druckpunkt gedrückt wird und langsam wieder in die Ausgangsposition bewegt wird. Um die Probe abzugeben, wird der Kolben nun bis zum zweiten Druckpunkt gedrückt. Am Ende des Pipettiervorgangs wird ein zusätzlicher Ausstossschritt (blow-out ) ausgeführt.
- Pipettenkolben bis zum ersten Druckpunkt (First stop) (1 & 2)
- Pipettenspitze senkrecht (90°) in die Flüssigkeit tauchen
- Kolben langsam loslassen, dabei wird das gewünschte Volumen angesaugt (3).
- Flüssigkeit abgeben: Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken (First stop), dabei wird das Hauptvolumen abgegeben, dann bis zum zweiten Druckpunkt (Second stop) um den Rest abzugeben (blow-out ).
Rückwärtspipettieren (Reverse Pipetting)
Diese Technik wird empfohlen für das Pipettieren von viskosen, schäumenden oder flüchtigen Flüssigkeiten, wie z. B. Glycerol, Serum, Tween 20 oder Ethanol. Sie verhindert die Bildung von Tropfen und Luftblasen und ermöglicht eine höhere Übertragungseffizienz bei Proben, die leicht aufschäumen.
Beim Rückwärtspipettieren wird eine überschüssige Menge Flüssigkeit in die Pipettenspitze aufgenommen, indem der Kolben bis zum zweiten Druckpunkt gedrückt wird. Um die Probe abzugeben, wird der Kolben nur bis zum ersten Druckpunkt gedrückt – der überschüssige Teil verbleibt in der Pipettenspitze. Diese Restmenge kann anschliessend verworfen oder in das Ursprungsgefäss zurückgegeben werden.
Der Blow-Out-Schritt darf beim Rückwärtspipettieren niemals angewendet werden.
- Kolben bis zum zweiten Druckpunkt drücken (1 & 2).
- Pipettenspitze in die Flüssigkeit tauchen.
- Kolben langsam loslassen, dabei wird eine überschüssige Menge Flüssigkeit in die Pipettenspitze aufgenommen (3).
- Flüssigkeit abgeben: Kolben bis zum ersten Druckpunkt (First stop) drücken, dabei wird das gewünschte Volumen abgegeben. Der überschüssige Teil verbleibt in der Pipettenspitze (4). Diese Restmenge kann anschliessend entsorgt werden oder in das Ursprungsgefäss zurückgegeben werden.
Zusammenfassung: Vorwärts- und Rückwärtspipettieren mit Kolbenhubpipetten
| Merkmal | Vorwärtspipettieren | Rückwärtspipettieren |
|---|---|---|
| Standardmethode | ✅ Ja | ❌ Nur bei Bedarf |
| Einfache Anwendung | ✅ Sehr einfach | ⚠ Etwas komplexer |
| Geeignet für wässrige Lösungen | ✅ Ideal | ⚠ Möglich, aber nicht nötig, ideal für kleine Volumina |
| Geeignet für viskose Flüssigkeiten | ❌ Ungenau | ✅ Sehr gut geeignet |
| Geeignet für Schaumbildung | ❌ Risiko von Luftblasen | ✅ Reduziert Schaumbildung |
| Gefahr des Nachtropfens | ❌ Hoch | ✅ Gering |
| Flüssigkeitsverlust | ❌ Nein (alles wird abgegeben) | ⚠ Ja (Rest in der Spitze bleibt) |
Tabelle 2: Vorwärts- und Rückwärtspipettieren Vergleichstabelle
Tipps zur richtigen Pipettiertechnik
Die Tip-Touch Methode
Die Pipettenspitze berührt am Ende der Flüssigkeitsabgabe vorsichtig die Innenwand des Zielgefässes. Damit wird sichergestellt, dass auch der letzte Tropfen der Flüssigkeit vom Ende der Spitze abfliesst. Besonders geeignet für viskose Flüssigkeiten.
Pipettierhilfen
Pipettierhilfen sind Hilfsgeräte, die das sichere, kontrollierte und ergonomische Pipettieren mit Glas- oder Kunststoffpipetten ermöglichen – insbesondere bei Messpipetten, Vollpipetten und serologischen Pipetten .
| Pipettierhilfe | Funktionsweise | Geeignete Pipetten | Besonderheiten/Vorteile | Beispiele |
|---|---|---|---|---|
| Pasteurpipetten-Saughilfe (A) | Manuell, Saugen per Gummiball/Pumpmechanik | Pasteurpipetten | Präzise kleine Mengen, einfach & günstig | Gläserner Filler, Pipetten-Füllball |
| Pipettierball / Pipettierbirne (B) | Manuell, Drücken + Ventil | Vollpipetten, Messpipetten | Einfach, kostengünstig, robust | Hecht Assistent |
| Peleusball (C) | Manuell, Gummiball mit Ventil | Vollpipetten, Messpipetten, Einfachpipetten | Sicher, verhindert Verschlucken | Fischerbrand Safety Pipette Filler, Standard Peleusball |
| Pi-Pump / Drehmechanik (D) | Manuell, Aufziehen/Abgabe über Rädchen | Vollpipetten, Messpipetten | Exakte Kontrolle, ergonomisch | Pi-Pump, Pipetus Junior |
| Elektronische Pipettierhilfe (E) | Elektrisch, Saugen per Tastendruck | Messpipetten, Vollpipetten, serologische Pipetten | Schnelles Arbeiten, regulierbare Geschwindigkeit | Eppendorf Easypet, Pipetboy/-girl, Integra |
Tabelle 3: Pipettierhilfen Vergleichtabelle
Hinweis: Die Wahl der Pipettierhilfe hängt vom Pipettentyp, Volumenbereich und Arbeitsaufwand ab.
Anwendung des Peleusballs
1. Vorbereitung
- Peleusball fest auf das obere Ende der Glaspipette aufsetzen
- Prüfen, ob der Sitz dicht ist
2. Luft entleeren
- Das Ventil A (oberes Ventil) drücken und gleichzeitig den Ball zusammendrücken, um die Luft aus dem Peleusball entweichen zu lassen
3. Flüssigkeit ansaugen
- Die Spitze der Pipette in die Flüssigkeit tauchen
- Das Ventil S (seitliches Ventil) drücken: Der Ball dehnt sich aus, und die Flüssigkeit wird in die Pipette gesaugt
- Sobald die gewünschte Menge erreicht ist, Ventil loslassen
4. Flüssigkeit abgeben
- Zum kontrollierten Entleeren das Ventil E (unteres Ventil) drücken
- Durch leichtes Variieren des Drucks lässt sich die Abgabegeschwindigkeit regulieren
5. Nach Gebrauch
- Peleusball von der Pipette abziehen
- Pipette reinigen bzw. entsorgen und Peleusball trocken lagern
| Ventil | Bezeichnung | Funktion |
|---|---|---|
| A | Ablassen (oben) | Lässt Luft aus dem Ball entweichen |
| S | Saugen (seitlich) | Saugt Flüssigkeit in die Pipette |
| E | Entleeren (unten) | Gibt Flüssigkeit aus der Pipette kontrolliert ab |
Einflussfaktoren auf die Genauigkeit
Die Genauigkeit beim Pipettieren hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, darunter der Pipettentyp, die physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit, die Umgebungsbedingungen sowie die Erfahrung und Technik des Anwenders.
Insbesondere bei Kolbenhubpipetten und Voll- & Messpipetten spielen Dichte, Viskosität, Temperatur und Dampfdruck der Flüssigkeit eine entscheidende Rolle für das Messergebnis.
Flüssigkeitseigenschaften
- Dichte: Die Dichte der Flüssigkeit beeinflusst das aufgenommene Volumen, insbesondere bei Luftpolsterpipetten.
- Viskosität: Viskose Flüssigkeiten können an der Spitze haften bleiben und zu ungenauen Abgaben führen.
- Dampfdruck: Ein hoher Dampfdruck kann zu Blasenbildung und ungenauen Volumina führen. bei der entsprechenden Temperatur liegt (z. B. 35,8 g NaCl pro 100 mL Wasser bei 20 °C).
Temperatur
- Die Temperatur der Pipette, der Flüssigkeit und der Umgebung sollte konstant und möglichst raumtemperiert sein.
- Temperaturunterschiede können zu Volumenschwankungen führen.
Pipettentechnik
- Die richtige Handhabung der Pipette, einschliesslich Vorbenetzung der Spitze und korrekter Druckpunkte, ist entscheidend für präzise Ergebnisse.
- Langsames und kontrolliertes Ansaugen und Abgeben der Flüssigkeit ist wichtig.
Pipettentyp & Kalibrierung
- Die richtige Pipette für das gewünschte Volumen wählen.
- Regelmässige Kalibrierung ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
Pipettenspitzen
- Verwendung von kompatiblen und hochwertigen Pipettenspitzen.
- Der korrekte Sitz der Spitze auf der Pipette beeinflusst das Ergebnis.
Umgebung
- Stabile Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit sind wichtig.
- Vibrationen und Zugluft vermeiden.
Anwenderfehler
- Korrekte Handhabung der Pipette und Vermeidung von Bedienungsfehlern sind entscheidend.
- Übung und Feingefühl sind wichtige Voraussetzungen für genaues Pipettieren.
Wissens-Check: Pipetten
Welche Faktoren beeinflussen die Genauigkeit der Flüssigkeitsmessung?
Temperatur, Eigenschaften der Flüssigkeit (z. B. Viskosität), Wahl der richtigen Pipettenart, Justierung (In/Ex) nach ISO-Norm sowie die richtige Pipettenhaltung.
Quiz: Pipetten
Frage 1
Was versteht man unter einer Kolbenhubpipette?
Frage 2
Welche Faktoren beeinflussen das genaue Pipettieren?
Frage 3
Was bedeutet die Blow-Out-Technik beim Pipettieren?
Frage 4
Warum sollte man beim Rückwärtspipettieren keine Blow-Out-Technik anwenden?